Что такое Иммуноэлектрофорез?

Иммуноэлектрофорез (лат. iramunis свободный, избавленный от чего-либо -f- электрофорез) — метод электрофоретического разделения антигенов (или антител) в геле с последующим их проявленном посредством преципитации соответствующими антителами (или антигенами).

И. позволяет получать разнообразную информацию об отдельных компонентах сложной смеси антигенов без предварительного выделения этих компонентов в чистом виде, в т. ч. определять общее число антигенов в смеси; их относительную электрофоретическую подвижность, биохимические или энзим логические характеристики; количественное содержание каждого антигена; наличие в смеси искомого антигена; производить сравнение двух или более антигенных систем и др.

Возможности И. в характеристике [антител ограничены, т. к. антитела различной специфичности, но относящиеся к одному классу иммуноглобулинов, имеют одинаковую или очень близкую электрофоретическую подвижность. С помощью И. можно установить, к какой электрофоретической фракции иммуноглобулинов — или у — относятся исследуемые антитела. В остальном анализ антител с помощью И. не имеет каких-либо преимуществ перед их анализом методами диффузии в геле.

Наиболее широко применяемый вариант иммуноэлектрофореза, предложенный в г. Грабаром и Уилльямсом (Р. Grabar, С. Williams), представляет собой сочетание двух отдельных методов — метода электрофоретического разделения антигенов в агаровом геле и метода встречной двумерной иммунодиффузии. Принцип первого метод основан на неодинаковой электрофоретической подвижности антигенов, обусловленной тем, что при значении pH, соответствующем условиям опыта, различные антигены будут отличаться друг от друга величиной заряда их молекул. Т. к. неэлектрическая точка большинства антигенов лежит в кислой области значений pH, то электрофорез обычно проводят в щелочных буферных системах, в которых антигены передвигаются с различной скоростью к аноду и к концу электрофореза занимают положения на разном расстоянии от исходной позиции.

Однако при использовании для элоктрофореза агарового геля на подвижность антигенов в электрическом иоле оказывает сильное влияние так наз. электроэндосмос. Он обусловлен тем, что агар в щелочных условиях имеет отрицательный заряд, вследствие чего вблизи стенок капилляров агаровой губки скапливаются положительные ионы буфера, занимающие тем больший объем внутри капилляров, чем меньше диаметр последних и, следовательно, чем больше концентрация агарового геля. В электрическом поле эти ионы передвигаются к катоду, увлекая за собой жидкую фазу и находящиеся в ней молекулы антигенов. Т. о., в агаровом геле подвижность макромолекул определяется, с одной стороны, вектором заряда, двигающим молекулы антигена к аноду, а с другой — вектором электроэндосмоса, направленным в противоположную сторону, к катоду. Результирующая этих двух векторов будет определять скорость и направление движения антигенов в агаре. Так, например, при электрофорезе сывороточных белков в агаре (ионная сила буфера ,, pH ,) альбумин и а-глобулины, имеющие высокий отрицательны и заряд, передвигаются к аноду, тогда как Р- и у-глобулины, несмотря на отрицательный заряд их молекул, передвигаются к катоду, т. к. вектор электроэндосмоса превышает вектор заряда.

Метод встречной иммунодиффузии, применяемый на втором этапе И., основан на формировании внутри прозрачного геля видимого преципитата, образуемого в процессе встречной диффузии молекул антигена и добавленных после электрофореза молекул антител. Для осуществления встречной диффузии в агаровой пластинке вырезают траншею, которая располагается параллельно направлению движения антигенов и на некотором расстоянии от них. В траншею вносят иммунную сыворотку к исследуемым антигенам, после чего пластинку оставляют во влажной камере на сутки или более. За это время антитела сыворотки диффундируют из траншеи, а антигены — из мест, которые они заняли после электрофореза. В местах встречи образуется преципитат в виде дуги, форма и положение которой будут зависеть от количественного соотношения данного антигена и соответствующих антител и от его природы. Т. о., высокая разрешающая способность И., отличающая его от всех других методов иммунохимического анализа, объясняется не только различной электрофоретической подвижностью и константой диффузии антигенов, но и неодинаковым отношением антиген/антитело тело для всех пар исследуемой системы. Чувствительность описанного варианта И. довольно высокая и позволяет определить антиген при ею концентрации порядка мкг/мл.

В лабораторной практике часто используется другой вариант И., который в литературе часто называют иммуноосмофорезом или встречным электрофорезом. Разрешающая способность этого метода значительно ниже, и основная цель, с которой он применяется, заключается и получении быстрого ответа о наличии искомого антигена н большом количестве исследуемых проб с помощью моноспецифической сыворотки, содержащей антитела к атому антигену. В тех случаях, когда искомый антиген при электрофоре но и агаре передвигается к аноду, пси постановка иммуноосмофореза проводится на агаровой пластинке. С помощью штампа вырезают дна ряда лупок (но числу исследуемых проб) днем. - мм расположенных друг против друга на расстоянии - мм.

Ряд лунок со стороны анода па пол и я ют иммунной сывороткой, а лунки со стороны катода — исследуемыми пробами. Вследствие слабого заряда молекулы антител на счет электроэндосмоса будут передвигаться к катоду навстречу искомому антигену, имеющему анодную подвижность. В месте встречи образуется полоса преципитата, указывающая па присутствие антигена в исследуемой пробе. Анализ ста и более проб различного материала на присутствие искомого антигена может быть проведен с помощью иммунное - мофороза менее чем за час.

Разработаны варианты И., позволяющие получать количественную характеристику для каждого компонента исследуемой системы. Наиболее простые из них — рокет-иммуноэлектрофороз (англ, rocket ракота) и кросс - иммуноэлектрофороз. Принцип этих методов заключается в том, что электрофоретическое движение антигенов происходит в геле агарозы, смешанном с. иммунной сывороткой. Ройет-иммуноэлектрофороз позволяет исследовать одновременно большое число проб и даст информацию не только о наличии искомого антигена в пробе, но и о его количестве, что придает методу большую ценность для клинических исследований. Для его постановки на стекло наливают смесь агарозы с иммунной сывороткой (лучше моноспецифической) в предварительно подобранном соотношении и затем в геле со стороны катода вырезают ряд лунок, заполняемых исследуемыми пробами. При условиях электрофореза, позволяющих антигену медленно передвигаться в агарозном геле с иммунной сывороткой, формируется преципитат в форме ракеты. Площадь пика при постоянной концентрации антител пропорциональна количеству антигена в пробе. При наличии рефорейсантигена может быть построена калибровочная кривая, по которой легко определять количество искомого антигена в каждой пробе по высоте сформированного пика преципитата.

Кросс-иммуноэлектрофорез отличается от рокет-иммуноэлектрофореза тем, что позволяет проводить учет тех же характеристик одновременно на нескольких компонентах исследуемой пробы, если она представляет собой сложную антигенную смесь. Исследуемую пробу сначала подвергают простому электрофорезу в агарозном геле без сыворотки. После этого полосу геля, содержащую разделенные электрофорезом антигены, вырезают и помещают на краю более широкой стеклянной пластины, заполняя оставшуюся площадь этой пластины смесью агарозы с анти сывороткой. Стекло гелем помещают в прибор для электрофореза так, чтобы направление тока было перпендикулярно направлению первого электрофореза, а заключенные в агарозе антигены располагались со стороны катода. Антигены, передвигаясь в агарозе с антисывороткой, формируют преципитат также в форме пика, но с более широким основанием за счет большей площади, занимаемой каждым антигеном в агарозе после первого простого электрофореза.

Описанные здесь в общих чертах основные типы не исчерпывают всего многообразия встречающихся в литературе вариантов этого метода.